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16/07/2020

O que é eletroforese em gel?

 

A eletroforese é uma técnica comumente usada no laboratório para separar moléculas carregadas, como o DNA, de acordo com o tamanho.

 

  • Eletroforese em gel é uma técnica comumente usada em laboratórios para separar moléculas carregadas, como DNA, RNA e proteínas de acordo com seu tamanho.
  • As moléculas carregadas se movem através de um gel quando uma corrente elétrica é passada através dele.
  • Uma corrente elétrica é aplicada através do gel para que uma extremidade do gel tenha uma carga positiva e a outra extremidade tenha uma carga negativa.
  • O movimento das moléculas carregadas é chamado de migração. As moléculas migram em direção à carga oposta. Uma molécula com carga negativa será, portanto, puxada em direção à extremidade positiva (os opostos se atraem!).
  • O gel consiste de uma matriz permeável, um pouco como uma peneira, através da qual as moléculas podem viajar quando uma corrente elétrica é passada através dela.
  • Moléculas menores migram através do gel mais rapidamente e, portanto, viajam mais longe do que fragmentos maiores que migram mais lentamente e, portanto, percorrerão uma distância menor. Como resultado, as moléculas são separadas por tamanho.

 

Eletroforese do gel e DNA

  • A eletroforese permite distinguir fragmentos de DNA de diferentes comprimentos.
  • O DNA é carregado negativamente, portanto, quando uma corrente elétrica é aplicada ao gel, o DNA irá migrar para o eletrodo carregado positivamente.
  • Fios mais curtos de DNA se movem mais rapidamente através do gel do que fios mais longos, resultando na disposição dos fragmentos em ordem de tamanho.
  • O uso de corantes, etiquetas fluorescentes ou radioativas permite que o DNA no gel seja visto após a sua separação. Elas aparecerão como faixas no gel.
  • Um marcador de DNA com fragmentos de comprimentos conhecidos geralmente percorre o gel ao mesmo tempo que as amostras.
  • Comparando as bandas das amostras de DNA com as do marcador de DNA, é possível calcular o comprimento aproximado dos fragmentos de DNA nas amostras.

 

COMO É REALIZADA A ELETROFORESE EM GEL?

 

Preparando o gel

  • Os géis de agarose são normalmente usados para visualizar fragmentos de DNA. A concentração de agarose usada para fazer o gel depende do tamanho dos fragmentos de DNA com os quais você está trabalhando.
  • Quanto maior for a concentração de agarose, mais densa será a matriz e vice-versa. Os fragmentos menores de DNA são separados em maiores concentrações de agarose enquanto as moléculas maiores requerem uma menor concentração de agarose.
  • Para fazer um gel, a agarose em pó é misturada com um tampão eletroforese e aquecida a uma temperatura alta até que todo o pó de agarose tenha derretido.
  • O gel derretido é então derramado em uma bandeja de fundição de gel e um "pente" é colocado em uma extremidade para fazer poços para a amostra a ser pipetada.
  • Uma vez que o gel tenha esfriado e solidificado (agora será opaco em vez de transparente), o pente é removido.
  • Muitas pessoas agora usam géis pré-fabricados.
  • O gel é então colocado em um tanque de eletroforese e o tampão de eletroforese é derramado no tanque até que a superfície do gel seja coberta. O tampão conduz a corrente elétrica. O tipo de tampão utilizado depende do tamanho aproximado dos fragmentos de DNA na amostra.

 

Preparando o DNA para eletroforese

  • Um corante é adicionado à amostra de DNA antes da eletroforese para aumentar a viscosidade da amostra o que evitará que ela flutue para fora dos poços e para que a migração da amostra através do gel possa ser vista.
  • Um marcador de DNA (também conhecido como padrão de tamanho ou uma escada de DNA) é carregado no primeiro poço do gel. Os fragmentos no marcador são de um comprimento conhecido, portanto podem ser usados para ajudar a aproximar o tamanho dos fragmentos nas amostras.
  • As amostras de DNA preparadas são então pipetadas para os poços restantes do gel.
  • Quando isto é feito, a tampa é colocada no tanque de eletroforese, certificando-se de que a orientação do gel e dos eletrodos positivos e negativos esteja correta (queremos que o DNA migre através do gel para a extremidade positiva).

 

Separando os fragmentos

  • A corrente elétrica é então ligada para que o DNA carregado negativamente se mova através do gel em direção ao lado positivo do gel.
  • Comprimentos mais curtos de DNA se movem mais rápido do que comprimentos mais longos, de modo que se movem mais no tempo em que a corrente é passada.
  • A distância que o DNA migrou no gel pode ser julgada visualmente através do monitoramento da migração do corante tampão de carga.
  • A corrente elétrica é deixada ligada o tempo suficiente para garantir que os fragmentos de DNA se movam o suficiente através do gel para separá-los, mas não por tanto tempo que eles se desprendam da extremidade do gel.

 

 

Ilustração do equipamento de eletroforese de DNA usado para separar os fragmentos de DNA por tamanho. Um gel fica dentro de uma cuba com tampão. As amostras de DNA são colocadas em poços em uma das extremidades do gel e uma corrente elétrica passa através do gel. O DNA carregado negativamente se move em direção ao eletrodo positivo. Crédito da imagem: Genome Research Limited

 

Visualizando os resultados

  • Uma vez que o DNA tenha migrado o suficiente através do gel, a corrente elétrica é desligada e o gel é removido do tanque de eletroforese.
  • Para visualizar o DNA, o gel é corado com um corante fluorescente que se liga ao DNA, e é colocado em um transiluminador ultravioleta que mostrará o DNA corado como bandas brilhantes.
  • Alternativamente, o corante pode ser misturado com o gel antes de ser vertido.
  • Se o gel tiver funcionado corretamente, o padrão de faixa do marcador de DNA/tamanho padrão será visível.
  • É então possível julgar o tamanho do DNA em sua amostra imaginando uma linha horizontal que atravessa as bandas do marcador de DNA. Você pode então estimar o tamanho do DNA na amostra, comparando-o com a faixa mais próxima no marcador.


 

Ilustração mostrando faixas de DNA separadas em um gel. O comprimento dos fragmentos de DNA é comparado a um marcador que contém fragmentos de comprimento conhecido. Crédito da imagem: Genome Research Limited

 

Fonte: 

Texto extraído e traduzido do portal YourGenome 

(https://www.yourgenome.org/facts/what-is-gel-electrophoresis)